線(xiàn)粒體(tǐ)膜電(diàn)位（JC-1）檢測

線(xiàn)粒體(tǐ)膜電(diàn)位下降是細胞凋亡早期的标志(zhì)性事件，發生在細胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現之前，一旦線(xiàn)粒體(tǐ)膜電(diàn)位崩潰，細胞凋亡便不可(kě)逆轉。

所屬分(fēn)類：

流式細胞術

關鍵詞：線(xiàn)粒體(tǐ)膜電(diàn)位（JC-1）檢測

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檢測原理(lǐ)：

　　JC-1是一種廣泛用(yòng)于檢測線(xiàn)粒體(tǐ)膜電(diàn)位∆Ψm的理(lǐ)想熒光探針，可(kě)以檢測細胞、組織或純化的線(xiàn)粒體(tǐ)膜電(diàn)位。JC-1有(yǒu)單體(tǐ)和多(duō)聚體(tǐ)兩種存在形式，兩者發射光譜不同。在正常細胞内，線(xiàn)粒體(tǐ)膜電(diàn)位較高，JC-1聚集在線(xiàn)粒體(tǐ)的基質(zhì)中(zhōng)，形成聚合物(wù)，可(kě)産(chǎn)生紅色熒光；凋亡早期，線(xiàn)粒體(tǐ)膜電(diàn)位降低，JC1不能(néng)聚集在線(xiàn)粒體(tǐ)基質(zhì)中(zhōng)，此時JC-1為(wèi)單體(tǐ)，可(kě)産(chǎn)生綠色熒光。

　　通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變可(kě)檢測到細胞膜電(diàn)位的下降，可(kě)将JC-1熒光顔色的轉變作(zuò)為(wèi)細胞凋亡早期的檢測指标。常用(yòng)紅綠熒光的相對比例來衡量線(xiàn)粒體(tǐ)去極化的比例。

　　1、配制JC-1工(gōng)作(zuò)液：每20 uL JC-1（500×）加入9 mL超純水稀釋JC-1，渦旋混勻，再加入1 mL JC-1 Assay Buffer（10×），混勻後即為(wèi)JC-1工(gōng)作(zuò)液；

　　2、配制1×JC-1 Assay Buffer：用(yòng)超純水将JC-1 Assay Buffer（10×）稀釋10倍，配置好的1×JC-1 Assay Buffer保存于2~8°C；

　　3、設置陽性對照：用(yòng)細胞培養液将10 mM CCCP稀釋1000倍，使CCCP終濃度為(wèi)10μM，按照用(yòng)10μM CCCP孵育陽性對照樣本細胞；

　　4、收集細胞懸液并進行細胞計數，取5-10×10^5個細胞，300-500 g離心5 min，棄上清；

　　5、用(yòng)500 uL JC-1工(gōng)作(zuò)液重懸細胞，37°C孵育20 min；

　　6、孵育結束後，300-500 g離心5 min，棄上清；

　　7、用(yòng)預冷的1×JC-1 Assay Buffer洗細胞1次，300 g離心5 min，棄上清；

　　8、用(yòng)預冷的1×JC-1 Assay Buffer重懸細胞，用(yòng)流式細胞儀（選用(yòng)488nm激光，FITC、PE通道接收）進行上機分(fēn)析。

　　注：JC-1單體(tǐ)的最大激發波長(cháng)為(wèi)514 nm，最大發射波長(cháng)為(wèi)529 nm；JC-1聚合物(wù)的最大激發波長(cháng)為(wèi)585nm，最大發射波長(cháng)為(wèi)590 nm。實際觀察時，常規設置紅色熒光和綠色熒光即可(kě)。