質(zhì)粒/病毒轉染

所屬分(fēn)類：

細胞生物(wù)學(xué)

關鍵詞：質(zhì)粒/病毒轉染

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　　慢病毒轉染

　　1、應用(yòng)簡介：

　　慢病毒轉染是一種重要的基因轉染方法，具(jù)有(yǒu)穩定、高效、廣泛應用(yòng)等特點。通過慢病毒轉染，可(kě)以實現外源基因在宿主細胞中(zhōng)的穩定表達，為(wèi)基因功能(néng)研究、基因治療和細胞工(gōng)程等領域提供了重要的技(jì )術支持。

　　2、技(jì )術原理(lǐ)：

　　利用(yòng)慢病毒載體(tǐ)将外源基因導入宿主細胞，并将其整合入宿主細胞基因組中(zhōng)，從而實現外源基因的穩定表達。

　　3、實驗方法：

　　Step 1：慢病毒構建；

　　Step 2：細胞培養；

　　Step 3：慢病毒感染系數MOI的确定；

　　Step 4：轉染細胞；

　　Step 5：觀察熒光，确認轉染情況；

　　Step 6：WB或qPCR檢測确認慢病毒的幹擾或過表達程度。

　　4、技(jì )術總結：

　　（1）進行病毒操作(zuò)時最好使用(yòng)專用(yòng)生物(wù)安(ān)全櫃，避免污染。

　　（2）在轉染後，如果目的細胞系GFP熒光強度弱，可(kě)觀察293T平行對照組熒光強度，如果293T熒光強度也弱，需要考慮病毒液本身的問題，如果293T熒光強度正常，就需要考慮是不是目的細胞系屬于難轉染細胞系等其他(tā)原因。

　　（3）在轉染過程中(zhōng)常常遇到加入病毒液後或者加入Puromycin篩選後細胞狀态極差的情況，這個時候細胞通常比較脆弱，在已經确定好病毒液的量或者Puromycin篩選濃度時，多(duō)考慮是不是在轉染時細胞本身狀态不夠好（比如傳多(duō)代的細胞會難轉染的情況）。

　　（4）如果加Puromycin後細胞死亡較多(duō)，需要及時換液，以防死細胞釋放的有(yǒu)害物(wù)質(zhì)影響具(jù)有(yǒu)抗性的細胞生長(cháng)。

　　質(zhì)粒轉染

　　1、應用(yòng)簡介：

　　質(zhì)粒轉染是一種在分(fēn)子生物(wù)學(xué)和細胞生物(wù)學(xué)中(zhōng)廣泛使用(yòng)的技(jì )術，用(yòng)于将外源DNA(通常是克隆在質(zhì)粒載體(tǐ)中(zhōng)的DNA片段)導入到真核細胞(如哺乳動物(wù)細胞、植物(wù)細胞或酵母細胞)中(zhōng)。這種技(jì )術對于基因表達分(fēn)析、基因治療、蛋白質(zhì)生産(chǎn)以及研究基因功能(néng)等方面至關重要。

　　2、技(jì )術原理(lǐ)：

　　利用(yòng)電(diàn)穿孔、鈣磷共沉澱、脂質(zhì)體(tǐ)包裹等方法，使質(zhì)粒DNA通過細胞膜進入細胞質(zhì)，進而被細胞核攝取并表達。

　　3、實驗方法：

　　Step 1：質(zhì)粒構建；

　　Step 2：細胞培養；

　　Step 3：用(yòng)lipo3000做質(zhì)粒轉染；

　　Step 4：WB或qPCR檢測确認慢病毒的幹擾或過表達程度。

　　4、技(jì )術總結：

　　（1）質(zhì)粒的濃度：質(zhì)粒濃度的選取直接影響到轉染效率，通常建議使用(yòng)1-2ug/ml的質(zhì)粒。

　　（2）細胞密度：轉染前需注意細胞密度的選取，通常細胞密度不宜過于密集，否則會影響轉染效果。

　　（3）轉染劑：選擇适當的轉染劑可(kě)以提高轉染效率，目前常用(yòng)的轉染劑有(yǒu)Lipofectamine、JetPrime、PEl等

　　（4）轉染時間：不同種類的細胞對轉染時間有(yǒu)不同的要求，一般來說轉染時間不宜過長(cháng)或過短。