Real-time PCR實驗
所屬分(fēn)類：
實驗介紹
實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴增反應中(zhōng)，以熒光化學(xué)物(wù)質(zhì)測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環後産(chǎn)物(wù)總量的方法。通過内參或者外參法對待測樣品中(zhōng)的特定DNA序列進行定量分(fēn)析的方法。
Real-time PCR 就是在 PCR 擴增過程中(zhōng)，熒光信号被收集，轉化成為(wèi)擴增和熔解曲線(xiàn)，以實現對PCR 進程進行實時檢測。具(jù)體(tǐ)數據就是基線(xiàn)，熒光阈值和Ct值。Ct 值就是熒光值達到阈值時候的 PCR 循環次數，在PCR擴增的指數時期，模闆的ct值和該模闆的起始拷貝數存在線(xiàn)性關系，Ct 值跟初始模闆的量成反比
實驗流程
結果展示
實驗報告。包括實驗數據分(fēn)析、實驗方法及樣品的PCR擴增曲線(xiàn)，溶解曲線(xiàn)和标準曲線(xiàn)
實驗要點
一引物(wù)設計
二 操作(zuò)流程注意事項
1.由于Real-Time qPCR 靈敏度高，所以每個樣品至少要做 3 個平行孔，以防在後面的數據分(fēn)析中(zhōng)，由于 Ct 相差較多(duō)或者 SD 太大，無法進行統計分(fēn)析。
2.MasterMix 不要反複凍融，如果經常使用(yòng)，最好溶解後放在 4 度。
3.最好能(néng)在冰上操作(zuò)，所有(yǒu)成分(fēn)加完後，離心去除氣泡。
4.可(kě)以在PCR過程中(zhōng)使用(yòng)良好的實驗步驟減少殘餘污染。為(wèi)PCR樣品配制和擴增後分(fēn)析設計隔離的區(qū)域，在準備新(xīn)反應前更換手套。設置不含有(yǒu)模闆的陰性對照檢測污染，使用(yòng)預先混合的反應成份，而不是每個反應的每個試劑單獨加入。
5.需對每個數據組進行獨立研究，根據具(jù)體(tǐ)情形選擇最佳阈值。
服務(wù)說明
1）如果提供實驗材料，實驗材料必須保證新(xīn)鮮，請您采樣後立刻放入液氮中(zhōng)速凍或加入樣品穩定劑，并用(yòng)幹冰運輸。
2）如果樣品可(kě)以用(yòng)Trizol法提總RNA，也可(kě)以将樣品研磨後放在Trizol中(zhōng)。動物(wù)組織：50～100mg/mLTrizol，貼壁細胞：10cm^2/mLTrizol，懸浮細胞：5×10^6個，動植物(wù)，酵母細胞或細菌細胞：10×10^7個/mLTrizol。
3）如果提供RNA或cDNA，我們要對您提供的材料進行評估。
4）随樣請附樣本編号清單，組織類别。
我們提供的實時熒光定量PCR服務(wù)，相關注意事項：
1）請提供目的基因及内參引物(wù)及擴增條件，也可(kě)以提供引物(wù)序列，由本公(gōng)司合成。
2）如不能(néng)提供引物(wù)及引物(wù)序列，您一定要提供樣品及要擴增基因的詳細信息，例如您的樣品的種名(míng)及擴增基因在GenBank上的登錄号。
3）我們實驗室技(jì )術人員也可(kě)以根據基因信息自己設計引物(wù)，引物(wù)合成和實驗條件的摸索等費用(yòng)需要額外收取。
實驗報告。包括實驗數據分(fēn)析、實驗方法及樣品的PCR擴增曲線(xiàn)，溶解曲線(xiàn)和标準曲線(xiàn)
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