ELISA實驗

将可(kě)溶性的抗原或抗體(tǐ)結合到聚苯乙烯等固相載體(tǐ)上，利用(yòng)抗原抗體(tǐ)結合專一性進行免疫反應的定性和定量檢測方法。

所屬分(fēn)類：

分(fēn)子生物(wù)學(xué)

關鍵詞：ELISA實驗

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實驗介紹

酶聯免疫吸附測定enzyme linked immunosorbent assay（簡寫ELISA）指将可(kě)溶性的抗原或抗體(tǐ)結合到聚苯乙烯等固相載體(tǐ)上，利用(yòng)抗原抗體(tǐ)結合專一性進行免疫反應的定性和定量檢測方法。

　　ELISA的基礎是抗原或抗體(tǐ)的固相化及抗原或抗體(tǐ)的酶标記。結合在固相載體(tǐ)表面的抗原或抗體(tǐ)仍保持其免疫學(xué)活性，酶标記的抗原或抗體(tǐ)既保留其免疫學(xué)活性，又(yòu)保留酶的活性。在測定時，受檢标本(測定其中(zhōng)的抗體(tǐ)或抗原)與固相載體(tǐ)表面的抗原或抗體(tǐ)起反應。用(yòng)洗滌的方法使固相載體(tǐ)上形成的抗原抗體(tǐ)複合物(wù)與液體(tǐ)中(zhōng)的其他(tā)物(wù)質(zhì)分(fēn)開。再加入酶标記的抗原或抗體(tǐ)，也通過反應而結合在固相載體(tǐ)上。此時固相上的酶量與标本中(zhōng)受檢物(wù)質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應的底物(wù)後，底物(wù)被酶催化成為(wèi)有(yǒu)色産(chǎn)物(wù)，産(chǎn)物(wù)的量與标本中(zhōng)受檢物(wù)質(zhì)的量直接相關，故可(kě)根據呈色的深淺進行定性或定量分(fēn)析。

ELISA的檢測方法有(yǒu)直接法、間接法、競争法及雙抗夾心法，其中(zhōng)直接法和競争法應用(yòng)較少，應有(yǒu)最多(duō)的是雙抗夾心法，其在敏感性及特異性上有(yǒu)明顯的優勢。以雙抗夾心法為(wèi)例：

　　檢測原理(lǐ)

　　雙抗體(tǐ)夾心ELISA法。用(yòng)抗體(tǐ)包被于酶标闆上，實驗時樣品（或标準品）中(zhōng)的抗原會與包被抗體(tǐ)結合。後依次加入生物(wù)素化的抗體(tǐ)和辣根過氧化物(wù)酶标記的親和素，抗體(tǐ)與結合在包被抗體(tǐ)上的抗原結合，生物(wù)素與親和素特異性結合而形成免疫複合物(wù)，遊離的成分(fēn)被洗去。加入顯色底物(wù)(TMB)，TMB在辣根過氧化物(wù)酶的催化下呈現藍色，加終止液後變成黃色。用(yòng)酶标儀在450 nm波長(cháng)處測OD值，樣本抗原濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制标準曲線(xiàn)計算出樣品中(zhōng)抗原的濃度。

實驗流程

1.對應闆孔中(zhōng)加入100uL标準品工(gōng)作(zuò)液或樣本，37℃孵育90分(fēn)鍾。

2.棄掉闆内液體(tǐ)後，立即加入100uL生物(wù)素化抗體(tǐ)工(gōng)作(zuò)液，37℃孵育60分(fēn)鍾。

3.棄掉闆内液體(tǐ)，洗闆3次。

4.每孔加入100uLHRP酶結合物(wù)工(gōng)作(zuò)液,37℃孵育30分(fēn)鍾，棄掉闆内液體(tǐ)，洗闆5次。

5.每孔加入90uL底物(wù)溶液,37℃孵育15分(fēn)鍾左右。

6.每孔加入50uL終止液。

7.立即在450nm波長(cháng)下讀數，處理(lǐ)數據。

實驗展示

實驗報告，原始實驗數據，結果分(fēn)析

實驗要點

吸取樣品時，加樣吸頭不應黏附多(duō)餘的液體(tǐ)；
加樣時不可(kě)90度向孔中(zhōng)滴加液體(tǐ)，這樣會導緻液體(tǐ)殘留在吸頭上，加樣不準确；
實驗室使用(yòng)的微量加樣器應注意保養并定期校正。ELISA比較敏感，每孔加入液體(tǐ)量誤差會導緻最後讀數差别，因此避免儀器帶來誤差。
如果移液槍漏氣以至于加樣的量不夠，不能(néng)用(yòng)槍吸出再加；
每次加樣順序一緻，尤其底物(wù)、終止液順序一緻，保證每個孔顯色時間相同。
試劑盒使用(yòng)前室溫平衡30分(fēn)鍾:溫度是ELISA結合反應的重要影響因素,為(wèi)使所有(yǒu)樣本在一緻的溫度下反應，實驗前務(wù)必将所有(yǒu)的試劑平衡至室溫,包括檢測樣本,避免因溫度的動力學(xué)反應差異而導緻ELISA檢測結果的不準确。